技術(shù)簡介
pUC18是一種由pBR322改造而來的質(zhì)粒載體,全長2686bp。在質(zhì)粒的多克隆位點(MCS)上下游含有M13正向和反向引物結(jié)合位點,以便于對插入的DNA片段進行常規(guī)測序。本方法采取同源重組的策略代替?zhèn)鹘y(tǒng)的TA克隆,實現(xiàn)對任何PCR片段的快速克隆。
質(zhì)粒圖譜
克隆位點
PCR產(chǎn)物插入位點(SalI/XbaI):
構(gòu)建流程
一、注冊登錄
1. 登錄SMART載體快速構(gòu)建系統(tǒng)地址:http://49.234.53.21/login(僅PC端使用);
2. 點擊登錄框新用戶注冊,填寫紅色*必填項,點擊注冊即完成注冊。
二、訂單預(yù)填
1. 進入“我的訂單”,點擊右側(cè)的“新增”按鈕,進入新增訂單界面。在此界面可以查詢所有快構(gòu)載體信息、訂單預(yù)填或者提交訂單。
2. 在“載體名稱”處選擇目標(biāo)載體(支持模糊查詢:隨著輸入字符的增加,縮小待選范圍)。
3. 下拉框選擇填入“CAB04-pUC18-PCR產(chǎn)物快速克隆”,然后在“上游位點”選擇填入SalI位點,在“下游位點”選擇填入XbaI位點。
4. 在“樣品名稱”里輸入5個字符(為了避免和其他客戶樣品混淆,字母和數(shù)字組合使用),并將此名稱命名在寄送的已純化的PCR產(chǎn)物管子上。
5. 在“插入片段”里填入預(yù)估的插入片段DNA堿基數(shù)。
6. “是否已經(jīng)純化”:是:強烈建議提供已經(jīng)電泳切膠純化后的、不低于20ul的含指定同源臂的PCR產(chǎn)物(未純化的樣品在運輸和后續(xù)操作過程中有可能出現(xiàn)降解等意外情況)。否:提供含同源臂的PCR原液100ul或電泳切膠后含單一目標(biāo)條帶的膠塊,另收10元/樣的純化費。
7. “陽性克隆數(shù)”:客戶提交訂單時可以填寫一次性測序多少個陽性克隆,轉(zhuǎn)導(dǎo)生物也會根據(jù)實際提供的陽性克隆數(shù)進行更改。
8. “插入片段序列”: 在轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單需要粘貼待插入的整個目標(biāo)序列(連同預(yù)計的同源臂及兩端額外5-10個堿基),用于測序結(jié)果分析比對;在第三方測序的,可以不粘貼序列,隨便輸入一個字符代替。
9. 點擊右下方的“保存”按鈕。此訂單的相應(yīng)數(shù)據(jù)將作為草稿保存。如果后續(xù)需要修改此訂單,可以點擊“編輯”進行更改。
三、準(zhǔn)備待待克隆的PCR片段
A. 分別在用于擴增的正反引物的5’端直接加上同源臂序列(直接復(fù)制粘貼無需反向互補):5'TTGCATGCCTGCAGGTCGAC和5'GTACCCGGGGATCCTCTAGA。
如下:ABC01F: TTGCATGCCTGCAGGTCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNN
ABC01R: GTACCCGGGGATCCTCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNN
N代表用于特異擴增的特異引物序列。
A. 盡量使用優(yōu)質(zhì)的高保真酶擴增目標(biāo)片段(為了減小堿基突變概率,盡量不用含有Taq酶的PCR酶)。(客戶自主完成);
B. 瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,并切膠目標(biāo)條帶后純化回收。如果條帶比較弱,建議多做幾個體系的PCR產(chǎn)物,純化回收時用少量水反復(fù)過柱濃縮。
C. 已經(jīng)純化好的PCR樣品準(zhǔn)備好后,通知收樣員收樣。
D. 在“我的訂單”向右橫向拖拉直至看到“代理/收樣員”。直接電話聯(lián)系收樣員(沒有收樣員的地區(qū)請低溫快遞至指定地址,拒絕到付件)。
四、克隆及測序
1. 樣品送出后,在“我的訂單”頁面找到相應(yīng)訂單,點擊目標(biāo)訂單最右側(cè)的“編輯”按鈕,提交處于保存狀態(tài)的訂單。(注意:A.如果是新客戶,客戶信息在還沒有通過審核的情況下,訂單提交功能還沒有開通,請及時聯(lián)系轉(zhuǎn)導(dǎo)生物工作人員;B.一旦提交訂單,客戶將不能修改此訂單,如果需要修改調(diào)整,請通過官方QQ4000275066聯(lián)系工作人員)。
2. 轉(zhuǎn)導(dǎo)生物在收到樣品的2個工作日內(nèi)完成克隆構(gòu)建實驗,并進入下游的測序環(huán)節(jié)。
3. 在轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單:提供陽性克隆甘油菌一份+小提保種質(zhì)粒一份,收基礎(chǔ)構(gòu)建費用+40元/測序反應(yīng)+特異測序引物合成費用(5毛/堿基);轉(zhuǎn)導(dǎo)生物還負(fù)責(zé)測序數(shù)據(jù)的整理、比對和結(jié)果展示。
4. 指定第三方公司(武漢奧科鼎盛)測序的訂單:僅提供陽性克隆甘油菌一份,收基礎(chǔ)構(gòu)建費用+10元/測序反應(yīng)+特異測序引物合成費用(5毛/堿基);構(gòu)建成功后,直接交由第三方測序公司完成1個通用引物測序,并發(fā)送至客戶郵箱,客戶審視結(jié)果后,如需加測請客戶自行郵件溝通;根據(jù)實測反應(yīng)數(shù)(10元/反應(yīng))和加測引物堿基數(shù)(0.5元/bp),轉(zhuǎn)導(dǎo)直接收取相應(yīng)費用,客戶不需要向第三方測序公司支付。
五、結(jié)算和交付
1. 測序完成后,客戶審視實驗結(jié)果。確定無誤后,轉(zhuǎn)導(dǎo)生物根據(jù)實際測序反應(yīng)數(shù)和加測引物堿基數(shù)(通過訂單詳情頁可查看),再次核算結(jié)算金額并核銷收取相應(yīng)費用。
2. 結(jié)算完成,請通過官方QQ400027506通知交付相應(yīng)的陽性克隆甘油菌1ml(轉(zhuǎn)導(dǎo)測序的訂單還另含對應(yīng)的一份小提質(zhì)粒)。